بيماري هپاتيت B بوسيله ويروس HBV ایجاد می¬گردد. اين ويروس درخون، مني و مايعات واژينال وجود دارد و از طريق تماس جنسي، وسايل آلوده تزريق دارو و فرآورده¬های خونی منتقل می¬شود. همچنین زنان باردار آلوده به ویروس نیز ميتوانند از طريق جفت يا در موقع زايمان، ويروس را به طفل خود منتقل نمایند.
کمتر از ۱۰ درصد بزرگسالان بيماري را به شکل مزمن نشان ميدهند، در حالي که اين رقم در کودکاني که در موقع تولد آلوده شدهاند به ۹۰ درصد و در نوجوانان به ۳۰ – ۲۵ درصد ميرسد. گزارشها نشان داده است که ۹۰ درصد افراد مبتلا به ايدز به هپاتيت نيز آلوده شدهاند و از اين تعداد ۱۵ درصد، آن را به شکل مزمن نشان ميدهند. اين بيماري شايعتر و بسيار مسريتر از ايدز است.
در حال حاضر در دنيا تخمين زده ميشود حدود ۳۵۰ تا ۴۰۰۰۰۰۰۰۰ نفراز اين بيماري رنج می¬برند. در حال حاضر تقريباً 2/1 ميليون آمريكايي به HBV آلوده هستند. در سال ۱۳۵۹ در حدود ۳% جمعيت ايران آلوده به اين بيماري بودند. طي اين آمار پراکندگي جمعيت در استانهاي کشور متفاوت بود به طوريکه در استان سيستان و بلوچستان حدود ۵% و در استان فارس اين آلودگي حدود 7/1 % جمعيت را تشکيل ميداد. اين در حالي است که طي مطالعات اخير ميزان آلودگي در استان گلستان با 1/6% بيشترين ميزان را در بين استانهاي کشور دارا ميباشد. بيشترين راه انتقال اين ويروس از راه مادر به فرزند بوده است. در حال حاضر بيش از ۳۵% افراد در کشور در معرض اين ويروس هستند.
در كشور ما در حال حاضر حدود ۲۰۰۰۰۰۰ نفر آلوده به اين ويروس هستند و از اين تعداد حدود سيصد هزار نفر وارد فاز هپاتيت B شدهاند و که اگر بدون درمان رها شود، خطر بروز سيروز (فرسودگي كبد) و سرطان كبد در آنها افزايش مييابد.
همه ساله حدود پنج هزار نفر از عوارض ناشي از هپاتيت ويروسيB در ايران ميميرند. در ايالات متحده، هزينههاي پزشكي و اتلاف سرمايه ناشي از بيماريهاي كبدي همراه هپاتيت B حدود 700 ميليون دلار تخمين زده ميشود. اين ويروس هر ساله بيش از يک ميليون کشته در سراسر جهان ميدهد.
اصول real time PCR
تکنيک real time PCR به خاطر توانمندي منحصر بهفرد در سنجش يک اسيد نوکلوئيک مشخص همانند ژنوم يک ويروس در مقادير بسيار بالا و پايين (Broad dynamic range)و حساسيت بالا، تکنيک اصلي در امر تشخيص و تعيين مقدار اسيدهاي نوکلوئيک مختلف به حساب ميآيد. در طی یک سیکل کاری واکنش PCR real time سه قسمت در منحنی تکثیر آن قابل مشاهده می¬باشد که به قرار زیر است.
1. فاز پيش زمينه (background phase)
2. فاز لگاريتمي (log-linear phase)
3. فاز کفه (plateau)
فاز پيش زمينه که در آن مقدار سيگنال فلورسانس از محصول PCR هنوز قابل تشخيص براي دستگاه نميباشد. فاز لگاريتمي زماني مشخص ميشود که مقدار شدت فلورسانس توليد شده به واسطه محصولات PCR بيش از مقدار پيش زمينه اوليه که به طور اخص حاصل از شکسته شدن خود به خود پروب مورد استفاده ميباشد. فاز نهايي فاز کفه ميباشد که در آن تجمع محصولات PCR به حدي است که کارآيي واکنش به شدت پايين ميآيد و حالت خطي واکنش که در فاز لگاريتمي صادق بود، از بين ميرود.
برخلاف تکنيکهاي قديميPCR ، که تعيين مقدار اسيد نوکلئيک مبتني بر آناليز محصول PCR بر روي ژل ميباشد، تعيين مقدار اسيدهاي نوکلوئيک در طي فاز لگاريتمي نتايج بسيار دقيقتري را در بر دارد که علت اين امر ثابت بودن کارآيي تکثير(amplification efficiency) در طي فاز لگاريتمي است. در واقع هر گونه افزايش سيگنال فلورسانس در طي فاز لگاريتمي قابل تعميم مستقيم به افزايش مقدار محصول PCR در واکنش ميباشد.
در تکنيکهاي قديميتر شناسايي و سنجش مقدار محصول PCR در طي فاز لگاريتمي کاري بسيار مشکل بود زيرا اين تکنيکها به طور کامل مبتني بر آناليز محصول نهايي PCR هستند. اما در تکنيک real time PCR به علت سنجش مقدار محصول PCR در طي هر سيکل واکنش به واسطه ايجاد نور فلورسانس در فاز لگاريتمي و استفاده از اطلاعات آن براي سنجش مقدار اسيد نوکلئيک اوليه کاملاً مقدور است.
در تکنيک real time PCR سنجش مقدار اسيد نوکلئيک به واسطه استاندارد خارجي به طور معمول تحت عنوان سنجش مطلق (absolute quantitation) شناخته ميشود که علت اين امر آن است که تعداد مشخص اوليه در آن بر اساس واحدهای مختلف (copies/ml or IU/ml) بيان ميشود. رابطه بين غلظتهاي مختلف اسيد نوکلوئيک اوليه و نقطه تقاطع (Ct: crossing threshold )،که در آن سيگنال فلورسانت واکنش به بيشتر از سطح اوليه افزايش مييابد، يک رابطه کاملاً تکرارپذير ميباشد که اين امر متضمن تعيين مقدار اسيد نوکلوئيک مورد نظر ميباشد.
کيت تشخيص و سنجش مقدار ويروس هپاتيت B به روشreal time PCR نه تنها قادر به تشخيص صحيح و عاري از خطاي ويروس هپاتيت B می¬باشد بلکه می¬تواند انواع تيپهاي ويروس را بدون تفاوت در تيپ آن شناسايي و تعيين مقدار کند. در واقع کیت تهیه شده دارای توانایی تعیین مقدار کمی ویروس هپاتیت B (viral load) می¬باشد که در امر پایش بیماری هپاتیت B چه از نظر تعیین مقدار دوز داروی مصرفی توسط بیمار و یا تغییر دارو در حالاتی که بیمار نسبت به داروی مورد مصرف مقاومت پیدا کرده کاربرد دارد. برای امر تشخیص و تعیین مقدار ویروس هپاتیت B می¬توان نمونه¬های متفاوتی از جمله پلاسما، سرم، مایع مغزی نخاعی و غیره را مورد استفاده قرار داد اما معمول¬ترین نمونه مورد استفاده نمونه پلاسما می¬باشد. این کیت قابل استفاده بر روی دستگاههایی نظیر Rotor-Gene 3000و Rotor-gene 6000 می¬باشد.
استفاده از این کیت و آنالیز نتایج آن برای یک تکنسین آزمایشگاه به طور کامل مقدور می¬باشد به شرط آنکه اصول کار با سیستمهای مولکولی را فراگرفته باشد وهمچنین دستورالعمل استفاده از کیت را به طور کامل مطالعه کرده باشد. در واقع دستورالعمل کیت شامل کلیه اطلاعات در مورد کاربرد کیت وآنالیزهای مولکولی آن می¬باشد هر چند آنالیز بالینی بر عهده پزشک مربوطه می باشد.