محصولات زیست دارویی ، مانند واکسن ها، با استفاده از سلول های باکتریایی یا یوکاریوتی به عنوان میزبان تولید می شوند. سلولهای مورد استفاده برای تولید واکسن می توانند منبع طیف وسیعی از ناخالصیهای پیچیده، ناهمگن و بالقوه مضر باشند و DNA سلول میزبان از جمله آنهاست. DNA سلول میزبان باقیمانده در واکسن ممکن است منجر به ایجاد تومور یا تحریک واکنش های ایمنی گردد. بنابراین ، سازمانهای نظارتی از جمله WHO، به ازای هر دوز، میزان حداکثر 10 نانوگرم DNA باقی مانده در هر دوز واکسن تولید شده در سلولهای VERO را مجاز دانسته اند. کیت HCDNASED Quantitative Vero DNA Kit، به منظور بررسی و اندازه گیری کمی میزان باقیمانده سلولهای میزبان Vero در نمونه واکسن تولید شده و تخلیص شده به کار میرود.

شماره رفرانس

• BONHCDNA-24
• BONHCDNA-48
• BONHCDNA-96

شرح کیت

کیت  HCDNASEQ Vero Cellیک سیستم آماده مصرف برای تشخیص DNA سلول میزبان Vero از طریق واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) روی دستگاه‌های MIC PCR، Step One Plus Rotor-Gene Q  است. مستر A حاوی واکنش‌گرها و آنزیم‌هایی برای تکثیر اختصاصی قطعه ای به طول 94 جفت باز از ژنوم Vero Cell بوده و برای تشخیص مستقیم امپلیکون مورد نظر از طریق کانال فلورسنت Cycling Green در دستگاه‌های Rotor-Gene 3000 و Rotor-Gene 6000 ، MIC PCR، Step One Plus طراحی گردیده است.

بعلاوه، کیت HCDNASEQ Vero Cellحاوی سیستم ثانویه‌ تکثیر هترولوگ برای تشخیص احتمال وجود مهارکننده واکنش PCR است. این امر از طریق شناسایی کنترل داخلی (Internal Control) در کانال فلوروسنت Cycling Orange در دستگاه‌هایRotor-Gene 3000 ،Rotor-Gene 6000 ، MIC PCR، Step One Plus صورت می‌پذیرد. آستانه تشخیصی آنالیتیکال کیت HCDNASEQ Vero Cell در حضور IC کاهش نمی‌یابد. استانداردهای کیت شامل HCDNA QS 1–4 امکان تعیین کمی میزان DNA سلول Vero را فراهم می‌آورد.

اصول

تشخیص HCDNA توسط واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) بر اساس تکثیر مناطق خاص ژنوم ژنوم سلول Vero است. در واکنش Real-Time PCR محصول تکثیر شده از طریق رنگ‌های فلوروسنت شناسایی می‌شوند. مشاهده شدت فلوروسنت در حین واکنش PCR (به صورت Real-Time) تشخیص و کمی سازی محصولات در حال تکثیر را بدون نیاز به باز کردن مجدد لوله های واکنش پس از اجرای PCR ممکن می‌سازد.

اطلاعات عمومی

محصولات زیست دارویی، مانند واکسن ها، با استفاده از سلول های باکتریایی یا یوکاریوتی به عنوان میزبان تولید می شوند. سلولهای مورد استفاده برای تولید واکسن می توانند منبع طیف وسیعی از ناخالصیهای پیچیده، ناهمگن و بالقوه مضر باشند و DNA سلول میزبان از جمله آنهاست. از آنجا که DNA سلول میزبان باقیمانده در واکسن ممکن است منجر به ایجاد تومور یا تحریک واکنش های ایمنی گردد. بنابراین، سازمانهای نظارتی از جمله WHO ، به ازای هر دوز واکسن تولید شده در سلولهای Vero، میزان حداکثر 10 نانوگرم DNA باقی مانده را مجاز دانسته اند. کیت HCDNASEQ Quantitative Vero DNA Kit، به منظور بررسی و اندازه گیری کمی میزان باقیمانده سلولهای میزبان Vero در نمونه واکسن تولید شده و تخلیص شده به کار میرود.

محتویات کیت

نگهداری و انتقال کیت

کلیه محتویات این کیت باید در دمای ۲۰-  درجه سانتی گراد و در تاریکی نگهداری گردد. همچنین به منظور انتقال و جابه جایی کیت از یخ خشک استفاده نمایید. بیش از سه مرتبه منجمد و ذوب کردن کیت به هیچ وجه توصیه نمی گردد زیرا می تواند باعث کاهش در حساسیت کیت گردد. نگهداری کیت در دمای ۴ درجه سانتی گراد هیچ گاه نباید بیشتر از یک ساعت شود.

مواد و تجهیزات مورد نیاز که باید توسط کاربر تدارک دیده شود:

1. کیت استخراج DNA
2. سمپلر قابل­تنظيم­ و نوك سمپلر فيلتردار DNase free
3. سانتريفوژ روميزي
4. بلوك خنك كننده
5. وایتکس 10 درصد
6. گان و دستکش
7. لوله های 0.2 میکرولیتر
8. دستگاه Rotor-Gene ، MIC PCR، Step One Plus با کانال‌های فلوروسنت مخصوص Cycling Green و Cycling Orange
9. نرم افزار Rotor-Gene Q نسخه 1.7.94 نرم­افزار Rotor-Gene 6000 نسخه 1.7.65, 1.7.87, 1.7.94 و نرم افزار Rotor-Gene 3000 نسخه 6.0.23 و یا بالاتر.
10. استریپ‌ و کپ 0.1 ml برای استفاده در روتور 72 چاهکی یا لوله‌های 0.2 ml برای روتور‌های 36 چاهکی

نکات احتیاط عمومی

1. نگهداری­ و ­تخلیص ­نمونه­های ­مورد بررسی، کنترل­ها و محصولات حاصل از PCR باید در­محلی­کاملا جدا ­از محل­ نگهداری­ و­ آماده­سازی MasterMix صورت پذیرد.
2. همه مواد مورد نیاز کیت قبل از شروع کار باید به طورکامل در دمای اتاق ذوب شود.
3. بعد از ذوب شدن، کلیه مواد (به ویژه استانداردهای کیت ) را به خوبی پیپتاژ نمایید و به طور مختصر اسپین­ کنید. این امر برای جلوگیری از کاهش عملکرد­ کیت در طی ­زمان به طور کامل توصیه می­شود.
4. تمام مراحل مربوط به تهیه MasterMix باید بر روی یخ یا جعبه­های سرد(Cooling Box) انجام شود. استوک اصلی مربوط به Master Mix بعد از برداشتن مقدار مورد نیاز از آن باید به سرعت به فریزر منتقل شود.

هشدارها و محدودیت ها

1. پیشنهاد می شود هود و یا استیشن مورد استفاده قبل و بعد ازکار با وایتکس 10 درصد تمیز شودو همین طور بعداز کارلامپ UV زده شود .
2. پیشنهاد می شود محل استخراج DNA ، آماده سازی مخلوط واکنش از فضای اضافه کردن نمونه واکسن و نمونه استاندارد جدا باشند زیرا ممکن است نتایج مورد قبول به اشتباه خارج از محدوده گزارش شود.
3. پس از آماده سازی مخلوط واکنش، آن را درتاریکی نگهداری نمایید .

کنترل ها

1. نمونه: از محتویات اسید نوکلئیک حاصل از استخراج DNA استفاده شود.
2. کنترل منفی ‌(NTC): همواره یک نمونه کنترل منفی حاوی آب بجای نمونه استفاده شود.
3. استاندارد (STD): از استاندارد کیت بجای نمونه در یک واکنش استفاده گردد.

آماده سازی نمونه و نگهداری

1. به منظور تشخیص و تعیین مقدار HCDNA باید DNA را با استفاده کیت تخلیص DNA، استخراج نمایید. قبل از استخراج، نمونه واکسن را به مدت 5 دقیقه درg۱3۰۰-۸۰۰ سانتریفوژ کنید تا عوامل مزاحم جدا شده و از سوپ رویی جهت استخراج استفاده کنید.
2. نتایج منفی کاذب می‌توانند به دلیل حضور افزایش غلظت مهار کننده های واکنش PCR ، استخراج DNA غیر استاندارد ، انتقال نامناسب نمونه و یا غلظت کم نمونه، حضور آلوم و یا مهارکننده های دیگر ناشی گردد.

6. نوکلئیک­اسیدهای استخراج­ شده باید در دمای 20- درجه سانتی­گراد یا پایین­تر نگهداری شوند.
7. نمونه DNA ای که در دمای -20 و یا پایین­تر فریز نشده است قابل استفاده برای آزمایش نمی­باشد.

• ایمنی زیستی در آزمایشگاه های میکروبیولوژی و زیست-پزشکی چاپ پنجم

http://www.cdc.gov/biosafety/publications

کنترل داخلی

این کیت به همراه یک کنترل­داخلی برای مصرف­کننده نهایی تهیه­ شده ­است. این امر به کاربر ­نهایی اجازه­ می­دهد تا هم فرآیند تخلیص را چک کند و هم احتمال وجود مواد مهار­کننده PCR را بررسی نماید. به طور کل در این حالت کنترل­داخلی موجود در کیت را به مقدار 0.1 میکرولیتر به ازاء هر 1 میکرولیتر از حجم حل کردن نهایی HCDNA اضافه می شود. برای مثال اگر ژنوم تخلیص­شده  را در50 میکرولیترآب حل­می­کنیم باید در­هنگام تخلیص نمونه ی واکسن مربوط به آن به نمونه ی واکسن 5 میکرولیترکنترل داخلی اضافه می شود. به بیان دیگر حجم کنترل اضافه شده تنها تابعی از میزان الوشن (Elution) نهایی می باشد. این کنترل داخلی را می توان به طور مستقیم به بافر لیز اضافه نمود. این نکته قابل­ذکر­است که اضافه­کردن کنترل­داخلی به بافر ­لیز یا مخلوط بافر لیز و نمونه ی واکسن باید به صورت تازه­  صورت­گیرد. همچنین کنترل­ داخلی به هیچ عنوان نباید به خود نمونه به صورت مستقیم و در غیاب بافر ­لیز اضافه شود.­ همچنین می­توان کنترل ­داخلی را تنها در­ طی­ مرحله PCR اضافه کرد که در این حال هیچ گونه کنترلی بر روی مرحله تخلیص ­وجود­ نخواهد داشت. در این حالت 1 میکرولیتر کنترل­ داخلی به 14میکرولیتر MasterMix-HcDNA اضافه شده و سپس از این مخلوط مقدار 14 میکرولیتر با 6 میکرولیتر از نمونه تخلیص شده مخلوط می گردد.

آماده­سازی

آماد سازی با دو روش صورت میگیرد :

1. در صورتیکه کنترل­داخلی را در­مرحله استخراج و طی مراحل­آماده سازی­اضافه­کرده­اید، مقادیر لازم برای آماده سازی Master­Mix برای هر واکنش را برای­ هر­تست طبق جدول­زیر­آماده کنید. پس از آماده سازی محلول‌ها و انتقال آن به تیوب‌های واکنش، ابتدا نمونه کنترل منفی (NTC) را آماده کنید. برای این کار، 6 میکرولیتر از آب بدون نوکلئاز را به تیوب کنترل منفی اضافه نمایید. پس از انتقال به هود مختص نمونه، 6 میکرولیتر از نمونه استاندارد و 6 میکرولیتر از نمونه‌های HCDNA را به تیوب‌های مربوطه اضافه نمایید. سپس تیوب‌ها را در دستگاه ترمال سایکلر قرار داده و نمونه‌ها را نام‌گذاری کنید.

2. اگر از IC به عنوان یک کنترل مهار RT-PCR استفاده شود، اما نه به عنوان یک کنترل برای روش آماده سازی نمونه، Master Mix را مطابق توضیح تهیه نمایید:

 در این حالت ابتدا 1 میکرولیتر از کنترل داخلی را به  µl14 مستر A اضافه کنید و به آرامی پیپتاژ نمایید. سپس از این مخلوط، میزان 14 میکرولیتر برای هر واکنش استفاده نمایید. سپس به روشی که در بالا ذکر شد نمونه اضافه می شود.

نکته: لازم به ذکر است که در هر بار انجام تست یک لوله به عنوان No Template Control (NTC) باید گذاشته شود. بر اساس جدول فوق در NTC به جای نمونه استخراج شده آب استفاده می­شود. تیوبNTC  برای کنترل آلودگی واکنش کاربرد دارد.\

برنامه ریزی دمایی

به منظور انجام تست باید برنامه دمایی زیر برای دستگاه تعریف شود. سنجش طیف نشری (Acquisition) باید هم در کانال سبز (مربوط به سیگنال دریافتی از ژنوم HCDNA) و هم در کانال نارنجی (مربوط به سیگنال دریافتی از کنترل داخلی) انجام شود.

مقادیر دمایی هر قسمت در کادر زیر آورده شده است.

علاوه بر تعریف دمایی، دستگاه باید برای طیف سنجش فلورسنت نیز تنظیم گردد.

توجه نمایید که پس از انجام ریل تایم، ران انجام شده شرایط زیر را داشته باشد:

آنالیز نتایج

تعیین میزان ژنوم HCDNA تخلیص شده

استانداردهای تامین­شده در ­این­ کیت­ معادل یک ­نمونه تخلیص­شده با مقدار ژنوم HCDNA ­کاملا مشخص است. از آنجا که از هر نمونه تخلیص شده مقدار 6 میکرولیتر از ژنوم تخلیص شده با 14 میکرولیتر از MasterMix مخلوط می­شود باید همین روند به طور مشابه برای نمونه­های استاندارد نیز اعمال گردد. برای ترسیم منحنی استاندارد هر چهار استاندارد موجود در کیت در هر بار انجام تست باید به همراه نمونه­های مجهول مورد آنالیز قرار گیرد تا­ بتوان به واسطه­ منحنی استاندارد کشیده­شده میزان HCDNA در نمونه­های مجهول تعیین­گردد. برای ­انجام این­امر باید استانداردها به­ عنوان استاندارد در ­برنامه تعریف شوند و مقدار معادل استاندارد بر اساس فرمول زیر محاسبه شده و در نرم افزار دستگاه وارد شود. استانداردهای تامین شده در کیت به صورت ng/µl می­باشد. برای تعیین  مقدار HCNDA موجود در واکسن از رابطه زیر استفاده کنید:

• در نهایت میزان در میزان نهایی دوز واکسن ضرب کنید تا Final Residual DNA به ازای هر دوز مشخص شود.
• قبل از انجام آنالیز تعیین غلظت باید نتایج کانالها را بررسی نمایید تا از صحت انجام تست اطمینان حاصل نمایید:
• سیگنال فلورسانس در کانال (A.FAM=green) کاملا مشخص است.

نتیجه تست برای HCDNA مثبت است و نمونه تخلیص شده از نمونه ی واکسن حاوی HCDNA بوده است. در این حالت، وجود سیگنال فلورسانس در کانال Orange اهمیت ندارد زیرا در صورت بالا بودن غلظت اولیه ژنوم HCDNA سیگنال درکانال Orange می­تواند بسیار ضعیف باشد یا اصلا وجود نداشته باشد.  در این حالت می توانید آنالیزهای تعیین غلظت را انجام دهید و میزان DNA باقیمانده را گزارش نمایید.

• هیچ سیگنال فلورسانسی در کانال (A.FAM=Green channel) مشاهده نمی­­شود. در همین حین سیگنال در کانال Orangeمربوط به کنترل داخلی قابل مشاهده است. این حالت نشان دهنده عدم وجود HCDNA در نمونه واکسن می­باشد. همچنین مثبت بودن سیگنال حاصل از کانال Orange وجود هر گونه مهار کننده واکنشPCR  را منتفی می­کند.
• هیچ سیگنال فلورسانسی در کانالFAMو کانال Orange قابل مشاهده نیست.

در این حالت هیچ گونه نتیجه گیری در مورد تست نمی­توان انجام داد.­ احتمال وجود مهارکننده در تست شما وجود دارد. بنابراین تست باید دوباره تکرار شود.

اختصاصیت بالا

• دارای اختصاصیت 100%
• دارای Accuracy R² , ≥99

تشخیص دقیق کمی

• کمی سازی کاملا دقیق و قابل ردیابی بر اساس DNA Vero cell، منطبق با استاندارد های WHO
• قابل استفاده برای محاسبه­ی میزان DNA باقیمانده واکسن های ساخته شده بر پایه­ی Vero cell بر اساس استانداردهای کمی موجود در کیت

کنترل داخلی اگزوژن

• کنترل کلیه­ی فرآیند PCR و استخراج از طریق کنترل داخلی IC) ( موجود در کیت

حساسیت بالا

• دارای حساسیت 5 ng/μl، به احتمال 95%  

مسترمیکس آماده­ی مصرف

• مستر میکس حاوی تمامی مواد تشکیل دهنده­ی مورد نیاز برای واکنش PCR
• بدون نیاز به اضافه کردن مواد ضروری برای انجام تست PCR
• تضمین تکرار پذیری نتایج آزمایش
• سازگار با طیف گسترده ای از دستگاه های Real-time PCR از جمله، Rotor Gen 3000,6000، MIC و

ABI Quantstudio Real-time PCR System

دارای تأییدیه مجوز اداره کل تجهیزات پزشکی